पीसीआर प्रतिक्रियाओं में हस्तक्षेप कारक

पीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान, कुछ हस्तक्षेप करने वाले कारकों का अक्सर सामना करना पड़ता है।
पीसीआर की बहुत अधिक संवेदनशीलता के कारण, संदूषण को पीसीआर परिणामों को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक माना जाता है और यह गलत सकारात्मक परिणाम उत्पन्न कर सकता है।
समान रूप से महत्वपूर्ण विभिन्न स्रोत हैं जो झूठे-नकारात्मक परिणामों की ओर ले जाते हैं।यदि पीसीआर मिश्रण या प्रवर्धन प्रतिक्रिया के एक या एक से अधिक आवश्यक भागों को बाधित या बाधित किया जाता है, तो नैदानिक ​​​​परख में बाधा आ सकती है।इससे दक्षता कम हो सकती है और गलत नकारात्मक परिणाम भी हो सकते हैं।
निषेध के अलावा, नमूना तैयार करने से पहले शिपिंग और/या भंडारण की स्थिति के कारण लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड अखंडता का नुकसान हो सकता है।विशेष रूप से, उच्च तापमान या अपर्याप्त भंडारण से कोशिकाओं और न्यूक्लिक एसिड को नुकसान हो सकता है।सेल और टिश्यू फिक्सेशन और पैराफिन एम्बेडिंग डीएनए विखंडन और एक लगातार समस्या के जाने-माने कारण हैं (चित्र 1 और 2 देखें)।इन मामलों में, इष्टतम अलगाव और शुद्धिकरण भी मदद नहीं करेगा।

चित्रा 1 |डीएनए अखंडता पर स्थिरीकरण का प्रभाव
Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन ने दिखाया कि ऑटोप्सी के पैराफिन वर्गों से पृथक डीएनए की गुणवत्ता में काफी भिन्नता है।फिक्सेशन विधि के आधार पर अर्क में अलग-अलग औसत टुकड़े की लंबाई के डीएनए मौजूद थे।देशी जमे हुए नमूनों में और बफ़र्ड न्यूट्रल फॉर्मेलिन में तय होने पर ही डीएनए को संरक्षित किया गया था।अत्यधिक अम्लीय बूइन फिक्सेटिव या असंरचित, फॉर्मिक एसिड युक्त फॉर्मेलिन के उपयोग से डीएनए की महत्वपूर्ण हानि हुई।शेष अंश अत्यधिक खंडित है।
बाईं ओर, टुकड़ों की लंबाई किलोबेस जोड़े (केबीपी) में व्यक्त की जाती है

चित्र 2 |न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य की अखंडता का नुकसान
(ए) दोनों किस्में पर 3'-5 'अंतर के परिणामस्वरूप लक्ष्य डीएनए में विराम होगा।छोटे टुकड़े पर डीएनए का संश्लेषण अभी भी होगा।हालाँकि, यदि डीएनए के टुकड़े पर प्राइमर एनीलिंग साइट गायब है, तो केवल रैखिक प्रवर्धन होता है।सबसे अनुकूल मामले में, टुकड़े एक-दूसरे को पुन: संतृप्त कर सकते हैं, लेकिन पैदावार छोटी और पता लगाने के स्तर से नीचे होगी।
(बी) आधारों की हानि, मुख्य रूप से डीप्यूरिनेशन और थाइमिडीन डिमर गठन के कारण, एच-बांडों की संख्या में कमी और टीएम में कमी की ओर जाता है।लंबे समय तक गर्म रहने के चरण के दौरान, प्राइमर मैट्रिक्स डीएनए से पिघल जाएंगे और कम कठोर परिस्थितियों में भी एनील नहीं होंगे।
(सी) आसन्न थाइमिन बेस एक टीटी डिमर बनाते हैं।
एक और आम समस्या जो अक्सर आणविक निदान में होती है, वह है फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण की तुलना में लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड की कम-से-इष्टतम रिलीज।अत्यधिक मामलों में, यह झूठी नकारात्मकताओं से जुड़ा हो सकता है।सेल मलबे के लाइसिस या एंजाइमी पाचन को उबालने से काफी समय बचाया जा सकता है, लेकिन अपर्याप्त न्यूक्लिक एसिड रिलीज के कारण इस विधि का परिणाम अक्सर कम पीसीआर संवेदनशीलता में होता है।

प्रवर्धन के दौरान पोलीमरेज़ गतिविधि का निषेध

सामान्य तौर पर, निषेध का उपयोग कंटेनर अवधारणा के रूप में उन सभी कारकों का वर्णन करने के लिए किया जाता है जो उप-इष्टतम पीसीआर परिणामों की ओर ले जाते हैं।कड़ाई से जैव रासायनिक अर्थ में, अवरोध एंजाइम की गतिविधि तक सीमित है, यानी, यह डीएनए पोलीमरेज़ या उसके कोफ़ेक्टर (जैसे, Taq डीएनए पोलीमरेज़ के लिए Mg2+) की सक्रिय साइट के साथ बातचीत के माध्यम से सब्सट्रेट-उत्पाद रूपांतरण को कम या रोकता है।
नमूने या विभिन्न बफ़र्स और अभिकर्मकों वाले अर्क सीधे एंजाइम को बाधित कर सकते हैं या इसके कोफ़ेक्टर्स (जैसे EDTA) को ट्रैप कर सकते हैं, जिससे पोलीमरेज़ निष्क्रिय हो जाता है और बदले में कम या गलत नकारात्मक पीसीआर परिणाम होता है।
हालांकि, प्रतिक्रिया घटकों और लक्ष्य-युक्त न्यूक्लिक एसिड के बीच कई अन्योन्यक्रियाओं को भी 'पीसीआर अवरोधक' के रूप में नामित किया गया है।एक बार जब कोशिका की अखंडता अलगाव से बाधित हो जाती है और न्यूक्लिक एसिड जारी हो जाता है, तो नमूना और उसके आस-पास के समाधान और ठोस चरण के बीच बातचीत हो सकती है।उदाहरण के लिए, 'मैला ढोने वाले' गैर-सहसंयोजक अंतःक्रियाओं के माध्यम से एकल या दोहरे-फंसे डीएनए को बांध सकते हैं और लक्ष्य की संख्या को कम करके अलगाव और शुद्धिकरण में हस्तक्षेप कर सकते हैं जो अंततः पीसीआर प्रतिक्रिया पोत तक पहुंचते हैं।
सामान्य तौर पर, पीसीआर अवरोधक अधिकांश शरीर के तरल पदार्थ और नैदानिक ​​​​परीक्षणों (मूत्र में यूरिया, हीमोग्लोबिन और रक्त में हेपरिन), आहार पूरक (कार्बनिक घटक, ग्लाइकोजन, वसा, Ca2+ आयन) और पर्यावरण में घटकों (फिनोल) के लिए उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों में मौजूद होते हैं। , हैवी मेटल्स)

अधिक प्रचलित पीसीआर अवरोधक बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक कोशिकाओं, गैर-लक्षित डीएनए, ऊतक मेट्रिसेस के डीएनए-बाइंडिंग मैक्रोमोलेक्यूल्स और दस्ताने और प्लास्टिक जैसे प्रयोगशाला उपकरणों में पाए जा सकते हैं।निष्कर्षण के दौरान या बाद में न्यूक्लिक एसिड का शुद्धिकरण पीसीआर अवरोधकों को हटाने के लिए पसंदीदा तरीका है।
आज, विभिन्न स्वचालित निष्कर्षण उपकरण कई मैनुअल प्रोटोकॉल को प्रतिस्थापित कर सकते हैं, लेकिन 100% वसूली और/या लक्ष्यों की शुद्धि कभी हासिल नहीं की जा सकी है।शुद्ध न्यूक्लिक एसिड में संभावित अवरोधक अभी भी मौजूद हो सकते हैं या पहले से ही प्रभावी हो सकते हैं।अवरोधकों के प्रभाव को कम करने के लिए विभिन्न रणनीतियाँ मौजूद हैं।उपयुक्त पोलीमरेज़ का चुनाव अवरोधक गतिविधि पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है।पीसीआर निषेध को कम करने के लिए अन्य सिद्ध तरीके पोलीमरेज़ एकाग्रता बढ़ा रहे हैं या बीएसए जैसे एडिटिव्स लगा रहे हैं।
आंतरिक प्रक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण (आईपीसी) के उपयोग से पीसीआर प्रतिक्रियाओं का निषेध प्रदर्शित किया जा सकता है।
निष्कर्षण किट में सभी अभिकर्मकों और अन्य समाधानों को हटाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, जैसे कि इथेनॉल, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, आइसोप्रोपेनोल और फिनोल, न्यूक्लिक एसिड से पूरी तरह से धोने के चरण से अलग हो जाते हैं।उनकी एकाग्रता के आधार पर, वे पीसीआर को सक्रिय या बाधित कर सकते हैं।