पीसीआर प्रतिक्रियाओं में हस्तक्षेप कारक

पीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान, अक्सर कुछ हस्तक्षेप करने वाले कारकों का सामना करना पड़ता है।
पीसीआर की अत्यधिक संवेदनशीलता के कारण, संदूषण को पीसीआर परिणामों को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक माना जाता है और यह गलत सकारात्मक परिणाम उत्पन्न कर सकता है।
समान रूप से महत्वपूर्ण वे विभिन्न स्रोत हैं जो गलत-नकारात्मक परिणामों की ओर ले जाते हैं। यदि पीसीआर मिश्रण या प्रवर्धन प्रतिक्रिया के एक या अधिक आवश्यक भागों को बाधित या बाधित किया जाता है, तो निदान परख में बाधा आ सकती है। इससे दक्षता में कमी आ सकती है और गलत नकारात्मक परिणाम भी मिल सकते हैं।
अवरोध के अलावा, नमूना तैयार करने से पहले शिपिंग और/या भंडारण की स्थिति के कारण लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड अखंडता का नुकसान हो सकता है। विशेष रूप से, उच्च तापमान या अपर्याप्त भंडारण से कोशिकाओं और न्यूक्लिक एसिड को नुकसान हो सकता है। कोशिका और ऊतक निर्धारण और पैराफिन एम्बेडिंग डीएनए विखंडन के जाने-माने कारण हैं और एक लगातार समस्या है (चित्र 1 और 2 देखें)। इन मामलों में, इष्टतम अलगाव और शुद्धिकरण भी मदद नहीं करेगा।

चित्र 1 | डीएनए अखंडता पर स्थिरीकरण का प्रभाव
एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन ने दिखाया कि शव परीक्षण के पैराफिन खंडों से अलग किए गए डीएनए की गुणवत्ता में काफी भिन्नता थी। फिक्सेशन विधि के आधार पर अर्क में अलग-अलग औसत खंड लंबाई के डीएनए मौजूद थे। डीएनए को केवल देशी जमे हुए नमूनों और बफर्ड न्यूट्रल फॉर्मेलिन में फिक्स करने पर ही संरक्षित किया गया था। एक मजबूत अम्लीय बौइन फिक्सेटिव या अनबफर, फॉर्मिक एसिड युक्त फॉर्मेलिन के उपयोग से डीएनए का काफी नुकसान हुआ। शेष अंश अत्यधिक खंडित है।
बाईं ओर, टुकड़ों की लंबाई किलोबेस युग्म (kbp) में व्यक्त की गई है

चित्र 2 | न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों की अखंडता का नुकसान
(ए) दोनों स्ट्रैंड पर 3′-5′ का अंतर लक्ष्य डीएनए में एक ब्रेक का कारण बनेगा। डीएनए का संश्लेषण अभी भी छोटे टुकड़े पर होगा। हालाँकि, यदि डीएनए टुकड़े पर प्राइमर एनीलिंग साइट गायब है, तो केवल रैखिक प्रवर्धन होता है। सबसे अनुकूल मामले में, टुकड़े एक दूसरे को फिर से संतृप्त कर सकते हैं, लेकिन पैदावार छोटी और पता लगाने के स्तर से नीचे होगी।
(बी) मुख्य रूप से डिप्यूरिनेशन और थाइमिडीन डिमर गठन के कारण बेस की हानि, एच-बॉन्ड की संख्या में कमी और टीएम में कमी की ओर ले जाती है। विस्तारित वार्मिंग चरण के दौरान, प्राइमर मैट्रिक्स डीएनए से पिघल जाएंगे और कम कठोर परिस्थितियों में भी एनील नहीं होंगे।
(c) आसन्न थाइमिन क्षार एक TT डिमर बनाते हैं।
आणविक निदान में अक्सर होने वाली एक और आम समस्या फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण की तुलना में लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड की कम-से-कम इष्टतम रिहाई है। चरम मामलों में, यह गलत नकारात्मक परिणामों से जुड़ा हो सकता है। सेल मलबे के उबलते लिसिस या एंजाइमेटिक पाचन द्वारा बहुत समय बचाया जा सकता है, लेकिन इस पद्धति के परिणामस्वरूप अक्सर अपर्याप्त न्यूक्लिक एसिड रिलीज के कारण कम पीसीआर संवेदनशीलता होती है।

प्रवर्धन के दौरान पॉलीमरेज़ गतिविधि का अवरोध

सामान्य तौर पर, अवरोधन का उपयोग कंटेनर अवधारणा के रूप में किया जाता है, जो उन सभी कारकों का वर्णन करता है जो उप-इष्टतम पीसीआर परिणामों की ओर ले जाते हैं। सख्त जैव रासायनिक अर्थ में, अवरोधन एंजाइम की गतिविधि तक सीमित है, यानी, यह डीएनए पॉलीमरेज़ या इसके सहकारक (जैसे, Taq डीएनए पॉलीमरेज़ के लिए Mg2+) की सक्रिय साइट के साथ बातचीत के माध्यम से सब्सट्रेट-उत्पाद रूपांतरण को कम करता है या रोकता है।
नमूने में उपस्थित घटक या अभिकर्मकों से युक्त विभिन्न बफर्स ​​और अर्क एंजाइम को सीधे बाधित कर सकते हैं या इसके सहकारकों (जैसे EDTA) को फंसा सकते हैं, जिससे पॉलीमरेज़ निष्क्रिय हो जाता है और परिणामस्वरूप PCR परिणाम कम या गलत नकारात्मक हो सकते हैं।
हालांकि, प्रतिक्रिया घटकों और लक्ष्य-युक्त न्यूक्लिक एसिड के बीच कई अंतःक्रियाओं को 'पीसीआर अवरोधक' भी कहा जाता है। एक बार जब सेल की अखंडता अलगाव द्वारा बाधित हो जाती है और न्यूक्लिक एसिड जारी हो जाता है, तो नमूने और उसके आसपास के घोल और ठोस चरण के बीच अंतःक्रिया हो सकती है। उदाहरण के लिए, 'स्कैवेंजर्स' गैर-सहसंयोजक अंतःक्रियाओं के माध्यम से एकल या दोहरे स्ट्रैंडेड डीएनए को बांध सकते हैं और अंततः पीसीआर प्रतिक्रिया पोत तक पहुंचने वाले लक्ष्यों की संख्या को कम करके अलगाव और शुद्धिकरण में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
सामान्य तौर पर, पीसीआर अवरोधक अधिकांश शारीरिक तरल पदार्थों और नैदानिक ​​​​निदान परीक्षणों (मूत्र में यूरिया, रक्त में हीमोग्लोबिन और हेपरिन), आहार पूरक (कार्बनिक घटक, ग्लाइकोजन, वसा, Ca2+ आयन) और पर्यावरण में घटकों (फेनोल, भारी धातु) के लिए उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों में मौजूद होते हैं।

अधिक प्रचलित पीसीआर अवरोधक बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक कोशिकाओं, गैर-लक्ष्य डीएनए, ऊतक मैट्रिक्स के डीएनए-बाइंडिंग मैक्रोमोलेक्यूल्स और दस्ताने और प्लास्टिक जैसे प्रयोगशाला उपकरणों में पाए जा सकते हैं। निष्कर्षण के दौरान या बाद में न्यूक्लिक एसिड का शुद्धिकरण पीसीआर अवरोधकों को हटाने के लिए पसंदीदा तरीका है।
आज, विभिन्न स्वचालित निष्कर्षण उपकरण कई मैनुअल प्रोटोकॉल की जगह ले सकते हैं, लेकिन लक्ष्यों की 100% रिकवरी और/या शुद्धिकरण कभी हासिल नहीं किया गया है। संभावित अवरोधक अभी भी शुद्ध किए गए न्यूक्लिक एसिड में मौजूद हो सकते हैं या पहले से ही प्रभावी हो सकते हैं। अवरोधकों के प्रभाव को कम करने के लिए विभिन्न रणनीतियाँ मौजूद हैं। उपयुक्त पॉलीमरेज़ का चुनाव अवरोधक गतिविधि पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। पीसीआर अवरोध को कम करने के लिए अन्य सिद्ध तरीके पॉलीमरेज़ सांद्रता को बढ़ाना या बीएसए जैसे योजक लागू करना है।
पीसीआर प्रतिक्रियाओं के अवरोध को आंतरिक प्रक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण (आईपीसी) के उपयोग से प्रदर्शित किया जा सकता है।
निष्कर्षण किट में सभी अभिकर्मकों और अन्य समाधानों को निकालने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए, जैसे कि इथेनॉल, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, आइसोप्रोपेनॉल और फिनोल, न्यूक्लिक एसिड आइसोलेट से पूरी तरह से धुलाई करके। उनकी सांद्रता के आधार पर, वे पीसीआर को सक्रिय या बाधित कर सकते हैं।