पीसीआर प्रतिक्रियाओं में हस्तक्षेप कारक

पीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान, कुछ हस्तक्षेप करने वाले कारकों का अक्सर सामना होता है।
पीसीआर की बहुत उच्च संवेदनशीलता के कारण, संदूषण को पीसीआर परिणामों को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक माना जाता है और यह गलत सकारात्मक परिणाम उत्पन्न कर सकता है।
समान रूप से महत्वपूर्ण विभिन्न स्रोत हैं जो झूठे-नकारात्मक परिणामों को जन्म देते हैं। यदि पीसीआर मिश्रण या प्रवर्धन प्रतिक्रिया के एक या अधिक आवश्यक भागों को स्वयं बाधित या हस्तक्षेप किया जाता है, तो नैदानिक ​​परख में बाधा उत्पन्न की जा सकती है। इससे दक्षता कम हो सकती है और यहां तक ​​कि झूठे नकारात्मक परिणाम भी हो सकते हैं।
निषेध के अलावा, नमूना तैयार करने से पहले शिपिंग और/या भंडारण की स्थिति के कारण लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड अखंडता का नुकसान हो सकता है। विशेष रूप से, उच्च तापमान या अपर्याप्त भंडारण से कोशिकाओं और न्यूक्लिक एसिड को नुकसान हो सकता है। सेल और ऊतक निर्धारण और पैराफिन एम्बेडिंग डीएनए विखंडन और एक लगातार समस्या के ज्ञात कारण हैं (आंकड़े 1 और 2 देखें)। इन मामलों में, यहां तक ​​कि इष्टतम अलगाव और शुद्धिकरण भी मदद नहीं करेगा।

चित्र 1 | डीएनए अखंडता पर स्थिरीकरण का प्रभाव
Agarose Gel वैद्युतकणसंचलन से पता चला है कि DNA की गुणवत्ता ऑटोप्सी के पैराफिन वर्गों से पृथक होती है, काफी भिन्न होती है। अलग -अलग औसत टुकड़े की लंबाई का डीएनए निर्धारण विधि के आधार पर अर्क में मौजूद था। डीएनए को केवल तब संरक्षित किया गया था जब देशी जमे हुए नमूनों में और बफर न्यूट्रल फॉर्मेलिन में तय किया गया था। एक दृढ़ता से अम्लीय बुइन फिक्सेटिव या असंबद्ध, फॉर्मिक एसिड युक्त फॉर्मेलिन के उपयोग से डीएनए का एक महत्वपूर्ण नुकसान हुआ। शेष अंश अत्यधिक खंडित है।
बाईं ओर, टुकड़ों की लंबाई किलोबेस जोड़े (KBP) में व्यक्त की जाती है

चित्र 2 | न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य की अखंडता का नुकसान
(ए) दोनों स्ट्रैंड्स पर एक 3′-5 ′ अंतराल के परिणामस्वरूप लक्ष्य डीएनए में एक ब्रेक होगा। डीएनए का संश्लेषण अभी भी छोटे टुकड़े पर होगा। हालांकि, यदि एक प्राइमर एनीलिंग साइट डीएनए टुकड़े पर गायब है, तो केवल रैखिक प्रवर्धन होता है। सबसे अनुकूल मामले में, टुकड़े एक दूसरे को फिर से भर सकते हैं, लेकिन पैदावार छोटी और नीचे का पता लगाने के स्तर से नीचे होगी।
(बी) आधारों की हानि, मुख्य रूप से नियुक्ति और थाइमिडीन डिमर गठन के कारण, एच-बॉन्ड की संख्या में कमी और टीएम में कमी की ओर जाता है। लम्बी वार्मिंग चरण के दौरान, प्राइमर मैट्रिक्स डीएनए से दूर पिघल जाएंगे और कम कठोर परिस्थितियों में भी नहीं होंगे।
(c) आसन्न थाइमिन बेस एक टीटी डिमर बनाते हैं।
एक और सामान्य समस्या जो अक्सर आणविक निदान में होती है, वह है फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण की तुलना में लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड की कम-से-इष्टतम रिलीज। चरम मामलों में, यह झूठे नकारात्मक से जुड़ा हो सकता है। सेल मलबे के लिसीस या एंजाइमेटिक पाचन को उबलते हुए बहुत समय बचाया जा सकता है, लेकिन इस विधि के परिणामस्वरूप अक्सर अपर्याप्त न्यूक्लिक एसिड रिलीज के कारण कम पीसीआर संवेदनशीलता होती है।

प्रवर्धन के दौरान पोलीमरेज़ गतिविधि का निषेध

सामान्य तौर पर, निषेध का उपयोग उन सभी कारकों का वर्णन करने के लिए एक कंटेनर अवधारणा के रूप में किया जाता है जो सबप्टिमल पीसीआर परिणामों की ओर ले जाते हैं। एक सख्ती से जैव रासायनिक अर्थ में, निषेध एंजाइम की गतिविधि तक सीमित है, यानी, यह डीएनए पोलीमरेज़ या इसके कोफ़ेक्टर (जैसे, एमजी 2+ के लिए टीएक्यू डीएनए पोलीमरेज़) के सक्रिय साइट के साथ बातचीत के माध्यम से सब्सट्रेट-उत्पाद रूपांतरण को कम या रोकता है।
नमूने या विभिन्न बफ़र्स और अभिकर्मकों से युक्त अर्क में घटक सीधे एंजाइम को रोक सकते हैं या इसके कोफ़ैक्टर्स (जैसे EDTA) को फंसा सकते हैं, जिससे पोलीमरेज़ को निष्क्रिय कर दिया जा सकता है और बदले में कम या झूठे नकारात्मक पीसीआर परिणामों को कम किया जा सकता है।
हालांकि, प्रतिक्रिया घटकों और लक्ष्य युक्त न्यूक्लिक एसिड के बीच कई इंटरैक्शन को 'पीसीआर इनहिबिटर' के रूप में भी नामित किया गया है। एक बार जब कोशिका की अखंडता अलगाव से बाधित हो जाती है और न्यूक्लिक एसिड जारी हो जाता है, तो नमूना और इसके आसपास के समाधान और ठोस चरण के बीच बातचीत हो सकती है। उदाहरण के लिए, 'मैला ढोने वाले' गैर-सहसंयोजक इंटरैक्शन के माध्यम से एकल या डबल-फंसे हुए डीएनए को बांध सकते हैं और लक्ष्यों की संख्या को कम करके अलगाव और शुद्धि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो अंततः पीसीआर प्रतिक्रिया पोत तक पहुंचते हैं।
सामान्य तौर पर, पीसीआर अवरोधक अधिकांश शरीर के तरल पदार्थों और अभिकर्मकों में मौजूद होते हैं जिनका उपयोग नैदानिक ​​नैदानिक ​​परीक्षणों (मूत्र में यूरे, हीमोग्लोबिन और रक्त में हेपरिन), आहार की खुराक (कार्बनिक घटक, ग्लाइकोजन, वसा, सीए 2+ आयनों) और पर्यावरण (फेनोलोल्स, भारी धातुओं) में घटकों के लिए किया जाता है।

अधिक प्रचलित पीसीआर अवरोधक बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक कोशिकाओं, गैर-लक्ष्य डीएनए, डीएनए-बाइंडिंग मैक्रोमोलेक्यूलस के ऊतक मैट्रिसेस और प्रयोगशाला उपकरण जैसे दस्ताने और प्लास्टिक में पाए जा सकते हैं। निष्कर्षण के दौरान या बाद में न्यूक्लिक एसिड की शुद्धि पीसीआर अवरोधकों को हटाने के लिए पसंदीदा विधि है।
आज, विभिन्न स्वचालित निष्कर्षण उपकरण कई मैनुअल प्रोटोकॉल को बदल सकते हैं, लेकिन 100% रिकवरी और/या लक्ष्यों की शुद्धि कभी हासिल नहीं की गई है। संभावित अवरोधक अभी भी शुद्ध न्यूक्लिक एसिड में मौजूद हो सकते हैं या पहले से ही प्रभावी हो सकते हैं। अवरोधकों के प्रभाव को कम करने के लिए विभिन्न रणनीतियाँ मौजूद हैं। उपयुक्त पोलीमरेज़ की पसंद अवरोधक गतिविधि पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकती है। पीसीआर निषेध को कम करने के लिए अन्य सिद्ध तरीके पोलीमरेज़ एकाग्रता में वृद्धि कर रहे हैं या बीएसए जैसे एडिटिव्स को लागू कर रहे हैं।
पीसीआर प्रतिक्रियाओं के निषेध को आंतरिक प्रक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण (आईपीसी) के उपयोग द्वारा प्रदर्शित किया जा सकता है।
न्यूक्लिक एसिड से पूरी तरह से धोने के कदम से अलग -थलग से न्यूक्लिक एसिड को अलग करने से निष्कर्षण किट, जैसे कि इथेनॉल, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, ISOPROPANOL और PHENOL जैसे सभी अभिकर्मकों और अन्य समाधानों को हटाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। उनकी एकाग्रता के आधार पर, वे पीसीआर को सक्रिय या बाधित कर सकते हैं।