पीसीआर प्रतिक्रियाओं में हस्तक्षेप कारक

पीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान, कुछ हस्तक्षेप करने वाले कारक अक्सर सामने आते हैं।
पीसीआर की अत्यधिक संवेदनशीलता के कारण, संदूषण को पीसीआर परिणामों को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक माना जाता है और यह गलत सकारात्मक परिणाम उत्पन्न कर सकता है।
समान रूप से महत्वपूर्ण विभिन्न स्रोत हैं जो गलत-नकारात्मक परिणाम देते हैं। यदि पीसीआर मिश्रण या प्रवर्धन प्रतिक्रिया के एक या अधिक आवश्यक भागों को बाधित या हस्तक्षेप किया जाता है, तो नैदानिक ​​​​परख में बाधा आ सकती है। इससे कार्यक्षमता कम हो सकती है और गलत नकारात्मक परिणाम भी आ सकते हैं।
अवरोध के अलावा, नमूना तैयार करने से पहले शिपिंग और/या भंडारण की स्थिति के कारण लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड अखंडता का नुकसान हो सकता है। विशेष रूप से, उच्च तापमान या अपर्याप्त भंडारण से कोशिकाओं और न्यूक्लिक एसिड को नुकसान हो सकता है। कोशिका और ऊतक निर्धारण और पैराफिन एम्बेडिंग डीएनए विखंडन और एक लगातार समस्या के प्रसिद्ध कारण हैं (आंकड़े 1 और 2 देखें)। इन मामलों में, इष्टतम अलगाव और शुद्धिकरण भी मदद नहीं करेगा।

चित्र 1 | डीएनए अखंडता पर स्थिरीकरण का प्रभाव
एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन से पता चला कि शव परीक्षण के पैराफिन वर्गों से पृथक डीएनए की गुणवत्ता काफी भिन्न थी। निर्धारण विधि के आधार पर विभिन्न औसत टुकड़े की लंबाई का डीएनए अर्क में मौजूद था। डीएनए को केवल तभी संरक्षित किया गया था जब इसे देशी जमे हुए नमूनों और बफर्ड न्यूट्रल फॉर्मेलिन में तय किया गया था। अत्यधिक अम्लीय बौइन फिक्सेटिव या अनबफ़र्ड, फॉर्मिक एसिड युक्त फॉर्मेलिन के उपयोग से डीएनए का महत्वपूर्ण नुकसान हुआ। शेष अंश अत्यधिक खंडित है।
बाईं ओर, टुकड़ों की लंबाई किलोबेस जोड़े (केबीपी) में व्यक्त की गई है

चित्र 2 | न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों की अखंडता का नुकसान
(ए) दोनों स्ट्रैंड पर 3′-5′ के अंतर के परिणामस्वरूप लक्ष्य डीएनए में दरार आ जाएगी। डीएनए का संश्लेषण अभी भी छोटे टुकड़े पर होगा। हालाँकि, यदि डीएनए टुकड़े पर प्राइमर एनीलिंग साइट गायब है, तो केवल रैखिक प्रवर्धन होता है। सबसे अनुकूल स्थिति में, टुकड़े एक-दूसरे को फिर से संतृप्त कर सकते हैं, लेकिन पैदावार छोटी और पता लगाने के स्तर से नीचे होगी।
(बी) आधारों की हानि, मुख्य रूप से डीप्युरिनेशन और थाइमिडीन डिमर गठन के कारण, एच-बॉन्ड की संख्या में कमी और टीएम में कमी आती है। लंबे वार्मिंग चरण के दौरान, प्राइमर मैट्रिक्स डीएनए से पिघल जाएंगे और कम कठोर परिस्थितियों में भी नष्ट नहीं होंगे।
(सी) निकटवर्ती थाइमिन आधार एक टीटी डिमर बनाते हैं।
एक और आम समस्या जो अक्सर आणविक निदान में होती है वह है फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण की तुलना में लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड का कम-से-इष्टतम रिलीज। चरम मामलों में, इसे झूठी नकारात्मकताओं से जोड़ा जा सकता है। सेल मलबे के उबलने या एंजाइमेटिक पाचन से बहुत समय बचाया जा सकता है, लेकिन इस विधि के परिणामस्वरूप अक्सर अपर्याप्त न्यूक्लिक एसिड रिलीज के कारण कम पीसीआर संवेदनशीलता होती है।

प्रवर्धन के दौरान पोलीमरेज़ गतिविधि का निषेध

सामान्य तौर पर, निषेध का उपयोग उन सभी कारकों का वर्णन करने के लिए एक कंटेनर अवधारणा के रूप में किया जाता है जो उप-इष्टतम पीसीआर परिणामों की ओर ले जाते हैं। कड़ाई से जैव रासायनिक अर्थ में, निषेध एंजाइम की गतिविधि तक सीमित है, अर्थात, यह डीएनए पोलीमरेज़ या इसके सहकारक (उदाहरण के लिए, टैक डीएनए पोलीमरेज़ के लिए Mg2+) की सक्रिय साइट के साथ बातचीत के माध्यम से सब्सट्रेट-उत्पाद रूपांतरण को कम करता है या रोकता है।
नमूने में घटक या विभिन्न बफ़र्स और अभिकर्मकों वाले अर्क सीधे एंजाइम को रोक सकते हैं या इसके सहकारकों (जैसे EDTA) को फंसा सकते हैं, जिससे पोलीमरेज़ निष्क्रिय हो जाता है और बदले में नकारात्मक पीसीआर परिणाम कम या गलत हो जाते हैं।
हालाँकि, प्रतिक्रिया घटकों और लक्ष्य-युक्त न्यूक्लिक एसिड के बीच कई इंटरैक्शन को 'पीसीआर अवरोधक' के रूप में भी नामित किया गया है। एक बार जब कोशिका की अखंडता अलगाव से बाधित हो जाती है और न्यूक्लिक एसिड जारी हो जाता है, तो नमूने और उसके आसपास के समाधान और ठोस चरण के बीच बातचीत हो सकती है। उदाहरण के लिए, 'स्कैवेंजर्स' गैर-सहसंयोजक अंतःक्रियाओं के माध्यम से एकल या डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को बांध सकते हैं और अंततः पीसीआर प्रतिक्रिया पोत तक पहुंचने वाले लक्ष्यों की संख्या को कम करके अलगाव और शुद्धिकरण में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
सामान्य तौर पर, पीसीआर अवरोधक अधिकांश शरीर के तरल पदार्थों और नैदानिक ​​​​नैदानिक ​​​​परीक्षणों (मूत्र में यूरिया, रक्त में हीमोग्लोबिन और हेपरिन), आहार पूरक (कार्बनिक घटक, ग्लाइकोजन, वसा, सीए 2+ आयन) और पर्यावरण में घटकों (फिनोल) के लिए उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों में मौजूद होते हैं। , हैवी मेटल्स)

अधिक प्रचलित पीसीआर अवरोधक बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक कोशिकाओं, गैर-लक्ष्य डीएनए, ऊतक मैट्रिक्स के डीएनए-बाध्यकारी मैक्रोमोलेक्यूल्स और दस्ताने और प्लास्टिक जैसे प्रयोगशाला उपकरणों में पाए जा सकते हैं। निष्कर्षण के दौरान या बाद में न्यूक्लिक एसिड का शुद्धिकरण पीसीआर अवरोधकों को हटाने का पसंदीदा तरीका है।
आज, विभिन्न स्वचालित निष्कर्षण उपकरण कई मैनुअल प्रोटोकॉल की जगह ले सकते हैं, लेकिन लक्ष्यों की 100% पुनर्प्राप्ति और/या शुद्धि कभी हासिल नहीं की गई है। संभावित अवरोधक अभी भी शुद्ध न्यूक्लिक एसिड में मौजूद हो सकते हैं या पहले से ही प्रभावी हो सकते हैं। अवरोधकों के प्रभाव को कम करने के लिए विभिन्न रणनीतियाँ मौजूद हैं। उपयुक्त पोलीमरेज़ का चुनाव अवरोधक गतिविधि पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। पीसीआर अवरोध को कम करने के लिए अन्य सिद्ध तरीकों में पोलीमरेज़ एकाग्रता को बढ़ाना या बीएसए जैसे एडिटिव्स का उपयोग करना शामिल है।
आंतरिक प्रक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण (आईपीसी) के उपयोग से पीसीआर प्रतिक्रियाओं का निषेध प्रदर्शित किया जा सकता है।
निष्कर्षण किट में सभी अभिकर्मकों और अन्य समाधानों, जैसे इथेनॉल, ईडीटीए, सीईटीएबी, लीसीएल, जीयूएससीएन, एसडीएस, आइसोप्रोपेनॉल और फिनोल को न्यूक्लिक एसिड आइसोलेट से पूरी तरह से धोने के चरण से हटाने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए। अपनी एकाग्रता के आधार पर, वे पीसीआर को सक्रिय या बाधित कर सकते हैं।