पीसीआर प्रतिक्रियाओं में हस्तक्षेप कारक

पीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान, अक्सर कुछ हस्तक्षेप करने वाले कारकों का सामना करना पड़ता है।
पीसीआर की अत्यधिक संवेदनशीलता के कारण, संदूषण को पीसीआर परिणामों को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक माना जाता है और यह गलत सकारात्मक परिणाम उत्पन्न कर सकता है।
झूठे-नकारात्मक परिणामों की ओर ले जाने वाले विभिन्न स्रोत भी उतने ही महत्वपूर्ण हैं। यदि पीसीआर मिश्रण या प्रवर्धन अभिक्रिया के एक या एक से अधिक आवश्यक भागों को बाधित या बाधित किया जाता है, तो नैदानिक ​​परीक्षण में बाधा आ सकती है। इससे दक्षता में कमी आ सकती है और झूठे-नकारात्मक परिणाम भी मिल सकते हैं।
अवरोध के अलावा, नमूना तैयार करने से पहले परिवहन और/या भंडारण की स्थितियों के कारण लक्ष्य न्यूक्लिक अम्ल की अखंडता का ह्रास हो सकता है। विशेष रूप से, उच्च तापमान या अपर्याप्त भंडारण से कोशिकाओं और न्यूक्लिक अम्लों को क्षति पहुँच सकती है। कोशिका और ऊतक स्थिरीकरण और पैराफिन अंतःस्थापन डीएनए विखंडन के सुप्रसिद्ध कारण हैं और एक सतत समस्या है (चित्र 1 और 2 देखें)। इन मामलों में, इष्टतम पृथक्करण और शुद्धिकरण भी मददगार नहीं होगा।

चित्र 1 | डीएनए अखंडता पर स्थिरीकरण का प्रभाव
एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन से पता चला कि शव-परीक्षा के पैराफिन खंडों से पृथक किए गए डीएनए की गुणवत्ता में काफी भिन्नता थी। स्थिरीकरण विधि के आधार पर, अर्क में विभिन्न औसत खंड लंबाई के डीएनए मौजूद थे। डीएनए केवल तभी संरक्षित किया गया जब इसे मूल हिमीकृत नमूनों और बफर्ड न्यूट्रल फॉर्मेलिन में स्थिर किया गया। तीव्र अम्लीय बौइन स्थिरक या बफर्ड, फॉर्मिक अम्ल युक्त फॉर्मेलिन के उपयोग से डीएनए की महत्वपूर्ण क्षति हुई। शेष अंश अत्यधिक खंडित है।
बाईं ओर, टुकड़ों की लंबाई किलोबेस युग्म (kbp) में व्यक्त की गई है

चित्र 2 | न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों की अखंडता का नुकसान
(a) दोनों रज्जुकों पर 3′-5′ का अंतर लक्ष्य डीएनए में दरार पैदा करेगा। छोटे टुकड़े पर डीएनए संश्लेषण अभी भी होगा। हालाँकि, यदि डीएनए टुकड़े पर प्राइमर एनीलिंग स्थल अनुपस्थित है, तो केवल रैखिक प्रवर्धन होता है। सबसे अनुकूल स्थिति में, टुकड़े एक-दूसरे को पुनः संतृप्त कर सकते हैं, लेकिन परिणाम छोटे और संसूचन स्तर से नीचे होंगे।
(b) क्षारकों की हानि, मुख्यतः डीप्यूरिनेशन और थाइमिडीन द्विपद निर्माण के कारण, H-बंधों की संख्या में कमी और Tm में कमी लाती है। दीर्घकालीन तापन चरण के दौरान, प्राइमर मैट्रिक्स डीएनए से पिघलकर अलग हो जाएँगे और कम कठोर परिस्थितियों में भी तापानुशीतित नहीं होंगे।
(c) आसन्न थाइमिन क्षार एक TT डिमर बनाते हैं।
आणविक निदान में अक्सर होने वाली एक और आम समस्या फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण की तुलना में लक्ष्य न्यूक्लिक अम्लों का कम-से-कम इष्टतम विमोचन है। चरम मामलों में, यह गलत नकारात्मक परिणामों से जुड़ा हो सकता है। कोशिका मलबे के उबलने या एंजाइमी पाचन द्वारा काफ़ी समय बचाया जा सकता है, लेकिन इस विधि के परिणामस्वरूप अक्सर अपर्याप्त न्यूक्लिक अम्ल विमोचन के कारण कम पीसीआर संवेदनशीलता होती है।

प्रवर्धन के दौरान पोलीमरेज़ गतिविधि का निषेध

सामान्यतः, अवरोधन का उपयोग एक संग्राहक अवधारणा के रूप में उन सभी कारकों का वर्णन करने के लिए किया जाता है जो उप-इष्टतम पीसीआर परिणामों की ओर ले जाते हैं। जैवरासायनिक दृष्टि से, अवरोधन एंजाइम की गतिविधि तक सीमित होता है, अर्थात, यह डीएनए पोलीमरेज़ या उसके सहकारक (जैसे, Taq डीएनए पोलीमरेज़ के लिए Mg2+) के सक्रिय स्थल के साथ अंतःक्रिया के माध्यम से सब्सट्रेट-उत्पाद रूपांतरण को कम या रोकता है।
नमूने में घटक या अभिकर्मकों वाले विभिन्न बफर और अर्क सीधे एंजाइम को बाधित कर सकते हैं या इसके सहकारकों (जैसे EDTA) को फंसा सकते हैं, जिससे पॉलीमरेज़ निष्क्रिय हो जाता है और परिणामस्वरूप PCR परिणाम कम या गलत नकारात्मक हो सकते हैं।
हालाँकि, प्रतिक्रिया घटकों और लक्ष्य-युक्त न्यूक्लिक अम्लों के बीच कई अंतःक्रियाओं को 'पीसीआर अवरोधक' भी कहा जाता है। एक बार जब कोशिका की अखंडता पृथक्करण द्वारा भंग हो जाती है और न्यूक्लिक अम्ल मुक्त हो जाता है, तो नमूने और उसके आसपास के विलयन व ठोस प्रावस्था के बीच अंतःक्रियाएँ हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, 'स्कैवेंजर्स' असहसंयोजक अंतःक्रियाओं के माध्यम से एकल या द्वि-रज्जुक डीएनए को बाँध सकते हैं और अंततः पीसीआर प्रतिक्रिया वाहिका तक पहुँचने वाले लक्ष्यों की संख्या को कम करके पृथक्करण और शुद्धिकरण में बाधा डाल सकते हैं।
सामान्यतः, पीसीआर अवरोधक अधिकांश शारीरिक तरल पदार्थों और नैदानिक ​​परीक्षणों (मूत्र में यूरिया, रक्त में हीमोग्लोबिन और हेपरिन), आहार पूरकों (कार्बनिक घटक, ग्लाइकोजन, वसा, Ca2+ आयन) और पर्यावरण में घटकों (फिनोल, भारी धातु) के लिए उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों में मौजूद होते हैं।

अधिक प्रचलित पीसीआर अवरोधक बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक कोशिकाओं, गैर-लक्ष्य डीएनए, ऊतक मैट्रिक्स के डीएनए-बाइंडिंग मैक्रोमोलेक्यूल्स और प्रयोगशाला उपकरणों जैसे दस्ताने और प्लास्टिक में पाए जा सकते हैं। निष्कर्षण के दौरान या बाद में न्यूक्लिक अम्लों का शुद्धिकरण पीसीआर अवरोधकों को हटाने का पसंदीदा तरीका है।
आज, विभिन्न स्वचालित निष्कर्षण उपकरण कई मैनुअल प्रोटोकॉल की जगह ले सकते हैं, लेकिन लक्ष्यों की 100% पुनर्प्राप्ति और/या शुद्धिकरण कभी हासिल नहीं किया जा सका है। संभावित अवरोधक अभी भी शुद्ध किए गए न्यूक्लिक अम्लों में मौजूद हो सकते हैं या पहले ही प्रभावी हो चुके हो सकते हैं। अवरोधकों के प्रभाव को कम करने के लिए विभिन्न रणनीतियाँ मौजूद हैं। उपयुक्त पॉलीमरेज़ का चुनाव अवरोधक गतिविधि पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। पीसीआर अवरोध को कम करने के अन्य सिद्ध तरीके पॉलीमरेज़ सांद्रता बढ़ाना या बीएसए जैसे योजकों का प्रयोग करना हैं।
पीसीआर प्रतिक्रियाओं के अवरोध को आंतरिक प्रक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण (आईपीसी) के उपयोग द्वारा प्रदर्शित किया जा सकता है।
निष्कर्षण किट में मौजूद सभी अभिकर्मकों और अन्य विलयनों, जैसे इथेनॉल, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, आइसोप्रोपेनॉल और फिनॉल, को न्यूक्लिक एसिड पृथक्करण से पूरी तरह धोकर निकालने का ध्यान रखना चाहिए। उनकी सांद्रता के आधार पर, वे PCR को सक्रिय या बाधित कर सकते हैं।