पीसीआर प्रतिक्रियाओं में हस्तक्षेप कारक

पीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान, अक्सर कुछ बाधक कारकों का सामना करना पड़ता है।
पीसीआर की अत्यधिक संवेदनशीलता के कारण, संदूषण को पीसीआर परिणामों को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक माना जाता है और इससे गलत सकारात्मक परिणाम भी आ सकते हैं।
गलत-नकारात्मक परिणामों के विभिन्न कारण भी उतने ही महत्वपूर्ण हैं। यदि पीसीआर मिश्रण या प्रवर्धन अभिक्रिया के एक या अधिक आवश्यक भाग बाधित या प्रभावित होते हैं, तो नैदानिक ​​परीक्षण में बाधा आ सकती है। इससे दक्षता कम हो सकती है और यहां तक ​​कि गलत-नकारात्मक परिणाम भी आ सकते हैं।
अवरोध के अलावा, नमूना तैयार करने से पहले परिवहन और/या भंडारण की स्थितियों के कारण लक्षित न्यूक्लिक अम्ल की अखंडता में कमी आ सकती है। विशेष रूप से, उच्च तापमान या अपर्याप्त भंडारण से कोशिकाओं और न्यूक्लिक अम्लों को नुकसान हो सकता है। कोशिका और ऊतक स्थिरीकरण और पैराफिन एम्बेडिंग डीएनए विखंडन के ज्ञात कारण हैं और एक लगातार समस्या बनी हुई है (चित्र 1 और 2 देखें)। इन मामलों में, सर्वोत्तम पृथक्करण और शुद्धिकरण भी कारगर नहीं होगा।

चित्र 1 | डीएनए अखंडता पर स्थिरीकरण का प्रभाव
एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस से पता चला कि शव परीक्षण के पैराफिन सेक्शन से पृथक किए गए डीएनए की गुणवत्ता में काफी भिन्नता थी। फिक्सेशन विधि के आधार पर, अर्क में अलग-अलग औसत खंड लंबाई वाले डीएनए मौजूद थे। डीएनए केवल मूल जमे हुए नमूनों और बफरयुक्त तटस्थ फॉर्मेलिन में फिक्स करने पर ही संरक्षित रहा। प्रबल अम्लीय बोइन फिक्सेटिव या बफररहित, फॉर्मिक एसिड युक्त फॉर्मेलिन के उपयोग से डीएनए की काफी हानि हुई। शेष अंश अत्यधिक खंडित है।
बाईं ओर, खंडों की लंबाई किलोबेस जोड़े (केबीपी) में व्यक्त की गई है।

चित्र 2 | न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों की अखंडता का नुकसान
(a) दोनों स्ट्रैंड पर 3′-5′ गैप होने से लक्ष्य डीएनए में ब्रेक आ जाएगा। छोटे खंड पर डीएनए का संश्लेषण जारी रहेगा। हालांकि, यदि डीएनए खंड पर प्राइमर एनिलिंग साइट अनुपस्थित है, तो केवल रैखिक प्रवर्धन होगा। सबसे अनुकूल स्थिति में, खंड एक दूसरे को पुनः संतृप्त कर सकते हैं, लेकिन उपज कम होगी और पता लगाने योग्य स्तर से नीचे होगी।
(b) मुख्य रूप से डीप्यूरिनेशन और थाइमिडीन डाइमर निर्माण के कारण बेस की हानि से एच-बॉन्ड की संख्या में कमी और टीएम में कमी आती है। लंबे समय तक चलने वाले वार्मिंग चरण के दौरान, प्राइमर मैट्रिक्स डीएनए से अलग हो जाएंगे और कम कठोर परिस्थितियों में भी नहीं जुड़ेंगे।
(c) आसन्न थाइमिन बेस एक टीटी डाइमर बनाते हैं।
आणविक निदान में अक्सर होने वाली एक अन्य समस्या यह है कि फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण की तुलना में लक्ष्य न्यूक्लिक अम्लों का उत्सर्जन इष्टतम स्तर से कम होता है। गंभीर मामलों में, इसके कारण गलत नकारात्मक परिणाम आ सकते हैं। कोशिका अवशेषों के अपघटन या एंजाइमेटिक पाचन द्वारा काफी समय बचाया जा सकता है, लेकिन इस विधि से अक्सर अपर्याप्त न्यूक्लिक अम्ल उत्सर्जन के कारण पीसीआर की संवेदनशीलता कम हो जाती है।

प्रवर्धन के दौरान पॉलीमरेज़ गतिविधि का अवरोध

सामान्यतः, अवरोधन का उपयोग उन सभी कारकों को वर्णित करने के लिए एक व्यापक अवधारणा के रूप में किया जाता है जो पीसीआर के अनुपयुक्त परिणामों का कारण बनते हैं। विशुद्ध जैव रासायनिक अर्थ में, अवरोधन एंजाइम की गतिविधि तक ही सीमित है, अर्थात् यह डीएनए पॉलीमरेज़ के सक्रिय स्थल या उसके सहकारक (जैसे, टैग डीएनए पॉलीमरेज़ के लिए Mg2+) के साथ परस्पर क्रिया के माध्यम से सब्सट्रेट-उत्पाद रूपांतरण को कम या बाधित करता है।
नमूने में मौजूद घटक या अभिकर्मकों वाले विभिन्न बफर और अर्क सीधे एंजाइम को बाधित कर सकते हैं या इसके सहकारकों (जैसे ईडीटीए) को फंसा सकते हैं, जिससे पॉलीमरेज़ निष्क्रिय हो जाता है और बदले में पीसीआर के परिणाम कम या गलत नकारात्मक हो जाते हैं।
हालांकि, अभिक्रिया घटकों और लक्ष्य-युक्त न्यूक्लिक अम्लों के बीच कई अंतःक्रियाओं को 'पीसीआर अवरोधक' के रूप में भी जाना जाता है। पृथक्करण द्वारा कोशिका की अखंडता बाधित होने और न्यूक्लिक अम्ल के मुक्त होने के बाद, नमूने और उसके आसपास के विलयन तथा ठोस अवस्था के बीच अंतःक्रियाएं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, 'स्केवेंजर' गैर-सहसंयोजक अंतःक्रियाओं के माध्यम से एकल- या दोहरे-स्ट्रैंडेड डीएनए से बंध सकते हैं और अंततः पीसीआर अभिक्रिया पात्र तक पहुंचने वाले लक्ष्यों की संख्या को कम करके पृथक्करण और शुद्धिकरण में बाधा उत्पन्न कर सकते हैं।
सामान्य तौर पर, पीसीआर अवरोधक अधिकांश शारीरिक तरल पदार्थों और नैदानिक ​​निदान परीक्षणों के लिए उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों (मूत्र में यूरिया, रक्त में हीमोग्लोबिन और हेपरिन), आहार पूरकों (कार्बनिक घटक, ग्लाइकोजन, वसा, Ca2+ आयन) और पर्यावरण में मौजूद घटकों (फिनोल, भारी धातु) में पाए जाते हैं।

बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक कोशिकाओं, गैर-लक्षित डीएनए, ऊतक मैट्रिक्स के डीएनए-बाध्यकारी वृहद अणुओं और प्रयोगशाला उपकरणों जैसे दस्ताने और प्लास्टिक में अधिक प्रचलित पीसीआर अवरोधक पाए जा सकते हैं। निष्कर्षण के दौरान या बाद में न्यूक्लिक एसिड का शुद्धिकरण पीसीआर अवरोधकों को हटाने की पसंदीदा विधि है।
आजकल, विभिन्न स्वचालित निष्कर्षण उपकरण कई मैनुअल प्रक्रियाओं की जगह ले सकते हैं, लेकिन लक्ष्य पदार्थों की 100% पुनर्प्राप्ति और/या शुद्धिकरण अभी तक प्राप्त नहीं हो पाया है। शुद्ध किए गए न्यूक्लिक अम्लों में संभावित अवरोधक अभी भी मौजूद हो सकते हैं या पहले ही अपना प्रभाव डाल चुके हो सकते हैं। अवरोधकों के प्रभाव को कम करने के लिए विभिन्न रणनीतियाँ मौजूद हैं। उपयुक्त पॉलीमरेज़ का चयन अवरोधक गतिविधि पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। पीसीआर अवरोध को कम करने के अन्य सिद्ध तरीके पॉलीमरेज़ की सांद्रता बढ़ाना या बीएसए जैसे योजकों का प्रयोग करना हैं।
आंतरिक प्रक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण (आईपीसी) के उपयोग से पीसीआर प्रतिक्रियाओं के अवरोध को प्रदर्शित किया जा सकता है।
एक्सट्रैक्शन किट में मौजूद सभी अभिकर्मकों और अन्य विलयनों, जैसे कि इथेनॉल, ईडीटीए, सीईटीएबी, लीसीएल, गुएससीएन, एसडीएस, आइसोप्रोपेनॉल और फिनोल को अच्छी तरह से धोकर न्यूक्लिक एसिड आइसोलेट से पूरी तरह से हटा देना चाहिए। इनकी सांद्रता के आधार पर, ये पीसीआर को सक्रिय या बाधित कर सकते हैं।